酶聯(lián)免疫試劑盒是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用較廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測(cè)大分子抗原，后者用于測(cè)定特異抗體。
基本原理酶聯(lián)免疫試劑盒方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使酶聯(lián)免疫試劑盒方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。
酶聯(lián)免疫試劑盒操作步驟
1．確定本次檢測(cè)所需的已包被抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目。
2．將倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為對(duì)照。處理后的標(biāo)本按100ul每孔加入。
3．酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)90分鐘。
4．反應(yīng)后用自動(dòng)洗板機(jī)吸去酶標(biāo)板內(nèi)的液體；或甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體，再對(duì)著吸水紙拍幾下。洗滌2次。
5．將準(zhǔn)備好的生物素抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應(yīng)60分鐘。
6．0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右。
7．將準(zhǔn)備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應(yīng)30分鐘。
8．0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右。
9．按每孔0.1ml依次加入TMB顯色工作液，37℃避光反應(yīng)，反應(yīng)過程中，要經(jīng)常的觀察，當(dāng)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔差別不明顯時(shí)，即可加入TMB終止液0.1ml/孔。（顯色反應(yīng)不要超過30分鐘）。
10．用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定O.D.值。
11．根據(jù)樣品的吸光值在坐標(biāo)上找出對(duì)應(yīng)的濃度。用戶也可以使用各種應(yīng)用軟件來計(jì)算。應(yīng)記住由于樣品稀釋了N倍，其實(shí)際濃度應(yīng)該×N。
