鼠疫桿菌(YP-PLA/CA/3A)熒光PCR檢測試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：鼠疫桿菌(YP)核酸擴(kuò)增檢測試劑盒(PCR-三色熒光探針法)

Name ：Diagnostic Kit for Yersinia Pestis DNA （PCR tripartite Fluorescence Probing）

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測全血等樣本中的鼠疫桿菌，用于鼠疫桿菌感染的輔助診斷，其檢測結(jié)果僅供參考。

【檢驗原理】

本試劑盒用一對 PLA 基因特異性引物，一對 3A 基因特異性引物，一對 偽CAFL 基因特異性引物，分別結(jié)合一條特異性熒光探針，用三色熒光 PCR 技術(shù)對鼠疫桿菌(YP)DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

核酸提取液 1.5ml×2 管

酶液 50μl×1 管

YP 反應(yīng)液 1.0ml×1 管

YP 陽性質(zhì)控品 50μl ×1 管

陰性質(zhì)控品 250μl ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件和有效期】

試劑盒保存于-20±5℃，有效期 12 個月；

避免反復(fù)凍融，凍融次數(shù)不超過 5 次；試劑開瓶后，在室溫條件下放置時間不

應(yīng)超過 8 小時；運輸采用干冰（或者冰袋）保持低溫，運輸時間不應(yīng)超過 4 天。試

劑盒生產(chǎn)日期見產(chǎn)品標(biāo)簽。

【適用儀器】

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ

Opticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本要求】

標(biāo)本采集：用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管

保存運輸：上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過

6 個月，標(biāo)本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

取抗凝血下層血細(xì)胞 50uL，加入 100uL 雙蒸水吹勻

1.2DNA 提取

1) 對上述處理好的標(biāo)本加入等體積核酸提取液（固體標(biāo)本加入50uL核酸提取液），

100℃恒溫處理 10 分鐘，13,000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5ml

EP 管，-20℃保存；

2) DNA 的提取也可以采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑

盒（離心柱提取法），請嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性

對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑 YP 反應(yīng)液 酶液

用量（樣本數(shù)為 N） 20μl 1μl

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μl，分別加入相應(yīng)的反

應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）

NONE，請勿選擇 ROX 參比熒光。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時間 收集熒光信號

1 1 cycle 95℃ 10min 否

2 40 cycle

94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5. 結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出

現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍

內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上

下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2 結(jié)果判斷

FAM通道為 PLA基因檢測結(jié)果，CY5 通道為3A基因檢測結(jié)果，VIC通道為 CAFL

基因檢測結(jié)果。

1) 陽性：檢測樣本任意一個通道 Ct 值三個小于等于 35.0，且曲線有明顯的指

數(shù)增長期；

2) 可疑：檢測樣本任意一個通道 Ct 值大于 35.0 且小于 40.0，重復(fù)一次實驗，

如果 Ct 值仍小于 40.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期，為陽性，否則為陰性；

3) 陰性：三個通道均檢測不到樣本 Ct 值。

6. 檢測方法的局限性

Ø 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

Ø 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

Ø 陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

Ø 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

Ø 試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或

定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

Ø 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無明顯擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32；

以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

8. 產(chǎn)品性能指標(biāo)

陰陽性參考品符合率：8 份陽性參考品符合率為 100％；10 份陰性參考品符合

率為 100％。

低檢測限：2.0×102copies/ml。

精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數(shù)（CV）均≤3%。

【注意事項】

1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。

公司優(yōu)勢：
1）質(zhì)量：我司提供的的試劑為世界
2）價格：價格實惠，量大從優(yōu)。
4）服務(wù)：提供完整的售前、售后和售中服務(wù)。售后到底

如需訂購鼠疫桿菌(YP-PLA/CA/3A)熒光PCR檢測試劑盒，請聯(lián)系我們。

此外公司還提供：